蛋白诱导表达分子生物学实验精品课件.ppt

实验九,蛋白质的诱导表达,9.1.1实验目的,掌握蛋白质诱导表达的原理学习蛋白质诱导表达的方法了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点,外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品,需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞,基因工程的最终目的,主要步骤制备表达载体制备目的DNA将目的DNA克隆到载体上,操作1.酶切,去磷酸化2.胶回收纯化1.质粒纯化/PCR2.酶切3.胶回收纯化1.目的片断与载体连接2.转化非表达型宿主菌3.筛选阳性克隆菌落PCR,质粒提取酶,测序确定阅读框蛋白表达操作流程,转化表达宿主菌诱导优化表达目的蛋白纯化目的蛋白,1.转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株1.检测质粒稳定性2.确定表达时间和温度的最佳条件3.分析蛋白溶解性和活性4.SDS-PAGE,Western印迹等确定目的蛋白1.放大培养2.制备粗提物3.亲和纯化4.切除融合标签并去除蛋白酶,蛋白质表达系统,原核表达系统,真核表达系统,大肠杆菌,枯草芽胞杆菌,YEAST,CELLCULTURE,INSECTCELL,TRANSFERREDGENE,简单,便宜,大量,无修饰,复杂,昂贵,有修饰大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。,9.1.2原核表达的特点,细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译缺乏转录后加工系统，不能切除内含子,cDNA,表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏缺乏翻译后加工体系不溶性的包涵体,在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导充分诱导几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,数小时后达细胞总蛋白的50以上非诱导条件下可使目的基因完全处于沉默状态而不转录,结构基因编码-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。操纵子包括启动子、操纵基因和结构基因调节基因、阻遏蛋白乳糖阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。,9.1.3乳糖操纵子,9.1.4诱导原核表达的原理,E.ColiBL21（DE3）DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌体，其基因型为lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。,9.1.5蛋白原核表达载体,具备与克隆载体相同的条件自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。pET系列6HisTag（660Da-2kDa）pGEX系列GST（26kDa）pMAL系列MaltoseBindingProtein（52kDa）,pET系列,pGEX系列,pMAL系列,9.1.6融合蛋白,融合蛋白将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接,融合阅读框表达出一杂合蛋白融合标签1.保护目的蛋白使之不被降解2.用于检测和纯化目的蛋白3.增加目的蛋白在细胞质中的可溶性4.帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高其生物活性,9.1.7阅读框架的保证,pGEX系列,DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。影响转录水平的因素强启动子，强终止子等。影响翻译水平的因素SD序列，mRNA稳定性等。影响蛋白质水平的因素异源蛋白，易降解。,9.1.8影响表达效率的主要因素,9.1.9优化表达（1）,增加蛋白质溶解性及折叠温度37C蛋白质以聚集的形式表达包涵体30C可溶的有活性的蛋白细胞周质定位有利于蛋白折叠及二硫键的形成稀有密码子多数氨基酸都有一个以上的密码子,但有一些E.Coli很少使用,当异源目的基因的mRNA过表达时,tRNA的数量直接反应密码子的偏倚性,一个或多个tRNA的稀有或缺少会导致翻译的停止毒性基因和质粒稳定性抗生素的使用补充葡萄糖,提高翻译水平调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增加mRNA稳定性减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。化学诱导，温度诱导。提高蛋白质稳定性，防止降解。表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象）,9.1.9优化表达（2）,9.2.1实验器材,1、基因工程菌BL21DE3/pET28a-eGFP每位同学（20ml菌液/三角瓶）2、IPTG（乳糖结构类似物）3、LBKanr4、离心机,9.2.2实验步骤1,原核表达载体转化到BL21DE3菌株中。挑取单菌落于2mLKanLB培养基培养过夜。（已做）以5的比例转接于20mLKanrLB培养基中，培养约1小时至OD6000.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。取1mL菌液,制样作为未诱导对照。三角瓶中加入IPTG40uL0.5M至终浓度为1mM，继续培养。,取样分别于培养后，30,60，90,120,取1mL菌液制样。制样12000rpm离心1min，去掉上清。加入25uLddH2O，重悬充分分散细胞。加入25uL2SDS凝胶加样缓冲液，混匀。沸水浴5min蛋白质变性，取出后立即置于冰上。冷却后，冰箱冷藏,备用。,9.2.2实验步骤2,实验关键点,诱导和取样时要进行无菌操作。制备样品时,细菌培养基上清除干净,且要充分悬浮。每个时间点的样品要立即制样并做好标记。,如何通过调节IPTG的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性,思考题,下次实验,诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测,开始工作吧LETSBEGINNOW,